Mae'r Prosiect Gwrthgyrff Agored yn gydweithrediad ymchwil byd-eang a hyrwyddir ar y cyd gan UC Davis, NIH NeuroMab Facility, DSHB, ac Addgene. Ei nod yw mynd i'r afael â'r argyfwng atgenhedlu gwrthgyrff trwy safoni, tryloywder a rhannu agored. Nid menter rydd yw ei gweithrediad, ond proses beirianneg chwe cham sy'n weithredadwy, yn archwiliadwy ac yn atgynhyrchadwy.
1. Caffael Safonol a Chyflwyno Dilyniannau Genynnau Gwrthgyrff
Ffynhonnell: Mae celloedd B penodol antigen yn cael eu hynysu oddi wrth anifeiliaid sydd wedi'u himiwneiddio neu gleifion wedi'u hadfer gan ddefnyddio technoleg didoli cell B sengl (fel FACS). Mae mRNA BCR yn cael ei dynnu a'i chwyddo gan RT-PCR i gael y dilyniannau V(D)J cyflawn o'r cadwyni trwm ac ysgafn.
Gofynion Fformat: Rhaid i'r dilyniant fod ar ffurf FASTA a chynnwys anodiadau ar gyfer y darnau genyn V, D, a J.
Rhaid cynnwys gwybodaeth imiwnogen (enw antigen, rhywogaeth, gweithdrefn imiwneiddio).
Rhaid nodi'r tarddiad clonio (ee, "rhoddwr dynol #27, postio-SARS-haint CoV-2").
Llwyfan Cyflwyno: Cyflwyno data dilyniant amrwd trwy ffurflen "Suggest a Plasmid" Addgene.
Pwyntiau Allweddol: Rhaid i'r dilyniant fod yn enyn gwrthgorff ailgyfunol; gwaherddir cyflwyno gwrthgyrff di-dilyniant sy'n deillio o hybridomas.
2. Adeiladu Plasmid a Chynulliad Fector Mynegiant Peirianyddol
Dewis fector: Defnyddiwch fectorau mynegiant mamalaidd safonol (ee, pCMV neu pEF1 ), gan sicrhau bod y rhanbarth cyson IgG1 Fc a'r dilyniant Kozak yn cael ei gynnwys.
Dull Clonio: Defnyddiwch glonio cydosod Gibson neu Golden Gate i baru cadwyni trwm ac ysgafn yn naturiol, gan osgoi cyfuniadau ar hap.
Confensiynau Enwi Plasmid:
OpenAb_[Antigen]_[Rhywogaethau]_[CloneID]_v1
Enghraifft: OpenAb_SARS2_Spike_hu_047_v1
3. Cyflwyno ac Adolygu trwy Platfform Addgene
Cofnod Cyflwyno: Cyrchwch y ffurflen Addgene Suggest a Plasmid
Meini Prawf Adolygu: Dilyniant yn rhydd o halogiad a threigladau ffrâmshift; Mae Plasmid yn cynnwys hyrwyddwr a therfynwr cyflawn; Darparwch fap plasmid (ffeil .gb)
Amser Adolygu: Fel arfer 7-14 diwrnod busnes. Ar ôl ei gymeradwyo, mae ID Addgene (ee, #123456) yn cael ei neilltuo ac mae'r plasmid yn cael ei ychwanegu'n gyhoeddus at y gronfa ddata.
Canlyniad: Mae'r plasmid yn dod yn adnodd chwiliadwy byd-eang, sydd ar gael yn rhad ac am ddim i unrhyw ymchwilydd.
4. Cynhyrchu a Lanlwytho Data Dilysu Safonol
Dulliau Dilysu: Rhaid cydymffurfio â phum piler IWGAV (Gweithgor Rhyngwladol ar Ddilysu Gwrthgyrff):
|
Math Dilysu |
Dull |
Gofynion |
|
Dilysiad Genetig |
CRISPR dymchwel/tynnu'r protein targed i lawr |
Diflaniad neu ostyngiad sylweddol mewn bandiau WB |
|
Dilysiad Orthogonol |
Cymhariaeth â sbectrometreg màs neu ganlyniadau RNA-seq |
Patrwm mynegiant cyson |
|
Dilysiad Gwrthgyrff Annibynnol |
Croes{0}}dilysu gan ddefnyddio gwrthgyrff gyda gwahanol epitopau |
Canlyniadau cyson |
|
Dilysiad Swyddogaethol |
Assay niwtraleiddio, cytometreg llif |
Yn dangos swyddogaeth fiolegol ddisgwyliedig |
|
Dilysu Cais |
IHC, IF, WB, CC |
Staeniad penodol ar gyfer y cais targed |
Fformat Data:
Delweddau IHC/IF: Rhaid cynnwys rheolaeth negyddol (meinwe gnocio) a rheolaeth bositif.
Delweddau WB: Rhaid cynnwys marcwyr pwysau moleciwlaidd a rheolyddion mewnol (ee, -actin).
Rhaid lanlwytho pob delwedd mewn fformat TIFF di-golled, ynghyd â pharamedrau arbrofol (cymhareb gwanhau gwrthgyrff, amser datguddio).
Gofyniad Gorfodol: Rhaid cyhoeddi'r holl ddata dilysu ar y cyd â phlasmidau; nid yw'r naill na'r llall yn anhepgor.
5. Dosbarthiad a Defnydd Am Ddim Byd-eang
Dull Mynediad:
Ewch i Casgliad Plasmid Gwrthgyrff Addgene
Chwilio am y gwrthgorff targed (ee, "OpenAb_SARS2_Spike")
Cyflwyno Cytundeb Defnydd Anfasnachol (nid oes angen taliad)
Derbyn plasmid (5-10 diwrnod busnes fel arfer)
Canllawiau Defnydd:
Rhaid dyfynnu ID Addgene a ffynhonnell y dilyniant gwreiddiol yn y papur.
Anogwch gyflwyno data dilysu newydd yn ôl i Addgene i ffurfio ecosystem dolen gaeedig.
6. Adborth Parhaus ac iteriad Ecosystemau
Mecanwaith Adborth Data: Mae defnyddwyr yn uwchlwytho canlyniadau arbrofol newydd (ee, cymwysiadau newydd, adweithedd rhywogaethau newydd) i lwyfan Addgene, gan ffurfio cronfa ddata ddilysu ddeinamig.
Llywodraethu Cymunedol: Mae DSHB a NIH yn cyhoeddi adroddiadau ansawdd gwrthgyrff yn rheolaidd, gan ddileu gwrthgyrff aneffeithlon neu draws-adweithiol.
Canlyniadau: O 2025 ymlaen, gellir atgynhyrchu 89% o ymchwil sy'n defnyddio gwrthgyrff ffynhonnell agored yn annibynnol, sy'n llawer uwch na'r 45% ar gyfer gwrthgyrff masnachol.
